膠原蛋白
由于膠原是細(xì)胞外間質(zhì)成分，在體內(nèi)以不溶性大分子結(jié)構(gòu)存在，并與蛋白多糖、糖蛋白等結(jié)合在一起，因此膠原的制備包括材料的選擇、預(yù)處理、酸堿酶鹽水法提取、不同類型膠原的分離和純化。
預(yù)處理
除 膠原蛋白外，動(dòng)物骨中還含有油脂、多種礦物質(zhì)和其他雜質(zhì)，因此在被用于提取膠原蛋白之前必須進(jìn)行預(yù)處理。先剔除動(dòng)物骨上殘留的肉質(zhì)和肌腱等雜物，粉碎后用 正丁醇或正己烷萃取出骨油。最后除去骨中無(wú)機(jī)物以提高膠原蛋白的得率。除去骨中的礦物質(zhì)可用稀酸或EDTA溶液。有人用原料用5倍質(zhì)量的 1.0moL/LHCL脫鈣處理2d，用正乙烷脫脂后再用胃蛋白酶酶解，在加酶量150U/g，pH值1.7，37℃條件下處理120min，然后在固液 比1∶6的情況下抽提5h，在此條件下，提取率可達(dá)18%；還有人用EDTA溶液（pH7.4）浸泡骨料5d，可有效脫去骨料中的羥基磷灰石。
膠原蛋白的提取一般有三種方法：一是高壓輔助的物理方法；二是用溶劑預(yù)處理結(jié)合低溫或熱水抽提的化學(xué)方法，根據(jù)溶劑 的不同，可分為熱水浸提法、酸法、堿法、鹽法；三是用酶的生物化學(xué)法。一般來(lái)說(shuō)，高壓輔助和熱水抽提針對(duì)明膠的提取，而低溫抽提和酶法針對(duì)膠原的提取，但 其基本原理都是根據(jù)膠原蛋白的特性改變蛋白質(zhì)所在的外界環(huán)境，把膠原蛋白從其他蛋白質(zhì)中分離出來(lái)。
在實(shí)際提取過(guò)程中，不同提取方法之間往往相互結(jié)合，可以得到較好的提取效果。采用超高壓處理系統(tǒng)對(duì)原料給予高壓處理一段時(shí)間，使其組織結(jié)構(gòu)和膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生松弛、變性，便于分離提取。
水法
熱水提取法是將原料經(jīng)過(guò)除雜蛋白等前處理之后，在一定條件下直接用熱水浸提已經(jīng)變性了的膠原蛋白或
水提取膠原蛋白
膠原蛋白水解物，使用的溫度有100℃沸水浴、60-70℃、40-45℃。
酸法
酸法提取是利用一定濃度的酸溶液在一定的條件下提取膠原蛋白，主要采用低離子濃度酸性條件破壞分子
酸提取膠原蛋白間 鹽鍵和希夫堿，而引起纖維膨脹、溶解，采用酸法提取的膠原蛋白通常成為酸溶性膠原蛋白。酸溶解法可將沒(méi)有交聯(lián)的膠原分子溶解出來(lái)，也可溶解含有醛胺類交聯(lián) 鍵的膠原纖維，然后釋放到溶劑中。酸法是提取膠原蛋白比較常用和有效的方法，用低溫酸法提取的膠原最大程度的保持了其三螺旋結(jié)構(gòu)，適用于醫(yī)用生物材料及原 料的制備。通常的做法是將適當(dāng)濃度的酸液按一定料液比加入到經(jīng)過(guò)預(yù)處理的骨粉中，于0～25℃攪拌提取一定時(shí)間。在采用酸法進(jìn)行膠原蛋白的提取時(shí)，注意提 取溫度不宜過(guò)高，以免膠原蛋白的生物活性發(fā)生破壞。取樣經(jīng)前處理后，勻漿在低溫下用酸浸提，離心即可得酸溶性膠原蛋白（acid-soluble collagen，ASC）。作為溶劑使用的酸，主要有鹽酸、磷酸、甲酸、乙酸、蘋果酸、檸檬酸等，但大多數(shù)研究集中于乙酸抽提，像Maria Sadowska等用0.5mol/L檸檬酸在室溫下提取骨膠原蛋白，其提取率略低于乙酸提取。檸檬酸因不產(chǎn)生顏色和異味得以廣泛使用于食品工業(yè)的膠原蛋 白的提取。
酸法處理時(shí)，反應(yīng)強(qiáng)烈，水解徹底，多生成氨基酸混合物，而且使用酸提取時(shí)，根據(jù)酸濃度、水解溫度、水解時(shí)間等條件的 不同，可以得到分子量不均的膠原水解物。但是在即使中等濃度酸徹底水解過(guò)程中色氨酸也會(huì)全部被破壞，絲氨酸和酪氨酸也會(huì)部分被破壞，且設(shè)備腐蝕嚴(yán)重。因 此，酸法溶出生物醫(yī)用膠原要準(zhǔn)確控制酸度、溫度、時(shí)間等影響因素。由于各種不足，酸法很少單獨(dú)使用，一般和酶法配合。比如以豬皮為原料，在檸檬酸 (pH8.6)和胃蛋白酶協(xié)同下提取膠原蛋白。在處理后的豬皮中加0.05moL/L含有胃蛋白酶的檸檬酸溶液（pH2.5-3）處理一段時(shí)間，然后再用 NaCL鹽析，最后提取率為12.35%，提取物保持了完整三股螺旋結(jié)構(gòu)的I型膠原蛋白。還有人以雛雞胸軟骨為原材料，在0.5moL/L醋酸條件下經(jīng)胃 蛋白酶多次消化，在4℃，20000r條件下離心20min，最后應(yīng)用DEAE-Sephadex A-50進(jìn)行離子交換層析，之后透析，再用NaCL鹽析，最后得到純化的膠原蛋白Ⅱ型。
堿法
堿法提取即利用一定濃度的堿在一定的外界條件下提取膠原蛋白，堿處理法中常用的處理劑為石灰、氫氧
堿提取膠原蛋白工藝流程
化、鈉、碳酸鈉等，用氫氧化鈉浸提時(shí)效果較好。一般的是把樣品勻漿后，用堿溶液多次溶脹后，再離心提取。但由于易引起蛋白質(zhì)變性，如膠原肽鍵水解，含羥基、疏 基的氨基酸全部被破壞；所得產(chǎn)物等電點(diǎn)pH值較低，天冬酞胺和谷氨酞胺分別轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼岷凸劝彼?，得到的水解產(chǎn)物分子量較在酸性溶液中比低等問(wèn)題，若比 較嚴(yán)重的話，還會(huì)產(chǎn)生 D、L-型氨基酸消旋混合物，若D型氨基酸含量高過(guò)L 型氨基酸，則會(huì)抑制L-型氨基酸的吸收，有些D型氨基酸有毒，甚至有致癌、致畸和致突變的作用。而且堿法提取的含量較低，用氫氧化鈉從魷魚皮中提取堿溶性 膠原蛋白，其得率只有3%（以濕基計(jì)）。所以，若想提取結(jié)構(gòu)完整、使用安全的膠原蛋白，很少采用此方法。有關(guān)單獨(dú)采用堿法提取膠原蛋白的報(bào)道不多，一般是 堿法提取和酸法提法結(jié)合使用。比如在4℃條件下，魚骨用0.1moL/L的NaOH浸泡6h，再用2.5%NaCl浸泡6h去除雜蛋白，用10%的異丙醇 溶液去除脂肪，0.1moL/L的檸檬酸浸泡3d，最后得到無(wú)色無(wú)味的膠原蛋白，提取率為11.87%。
注意，無(wú)論酸法或堿法，均可有效地提取膠原蛋白，有人分別采用醋酸- 鹽酸的混合酸液（pH3.0）和NaOH溶液（pH12.0）提取骨膠原蛋白，提取率基本相當(dāng)。但是，這兩種方法提取膠原蛋白不僅容易影響膠原蛋白的生物 活性，而且提取后產(chǎn)生的酸性或堿性廢液必須進(jìn)行適當(dāng)處理，以避免對(duì)環(huán)境造成污染。
鹽法
鹽法提取是利用各種不同的鹽在不同的濃度條件下提取鹽溶性膠原蛋白的方法。常用來(lái)提取膠原的鹽有鹽
膠原蛋白鹽析工藝流程
酸 -三羥甲基胺基甲烷（Tris-HCl）、氯化鈉、檸檬酸鹽等。在中性條件下，當(dāng)鹽的濃度達(dá)到一定量時(shí)，膠原就會(huì)溶解在其中，但是膠原的溶解和分級(jí)受中性 鹽效應(yīng)影響，有的鹽可提高膠原的穩(wěn)定性，而有的則可降低其構(gòu)象穩(wěn)定性，從而對(duì)提取天然膠原蛋白很不利。此外，可采用不同濃度的氯化鈉對(duì)提取的膠原蛋白進(jìn)行 鹽析處理，可以沉淀出不同類型的膠原蛋白。
酶法
酶法提取是指可溶性膠原和酸溶性膠原被提取后，需用一些蛋白酶，如膠原酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和
鹽析后膠原蛋白電泳圖譜
胰凝乳蛋白酶等水解，得到不同的酶促溶性膠原蛋白。所使用的蛋白酶主要分3種：動(dòng)物蛋白酶（如胰蛋白酶，胃蛋白酶），植物蛋白酶（如木瓜蛋白酶，菠蘿蛋白酶），微生物蛋白酶（如堿性蛋白酶，中性蛋白酶）。在對(duì)酶法水解膠原蛋白的研究中，以堿性蛋白酶應(yīng)用最多。
將膠原進(jìn)行限制性降解，即將末端肽切割下來(lái)，由于膠原肽鏈間的共價(jià)鍵都是通過(guò)分子末端肽里的賴氨酸或羥賴氨酸的相互 作用形成的，末端肽被切下后，含三螺旋結(jié)構(gòu)的主體部分可溶于稀有機(jī)酸而被提取出來(lái)。用酶處理，可以水解掉膠原纖維蛋白的末端肽，提高膠原蛋白的產(chǎn)率；而且 還不會(huì)破壞膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)，保持其特性。影響酶提取的因素有很多，如酶濃度、酶與底物的比例、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH值以及料液比等。在實(shí)際操 作中，大多數(shù)采用酶復(fù)合法提取膠原蛋白，較多的是使用胃蛋白酶提取，有機(jī)酸多為乙酸。
酶解膠原蛋白的工藝主要分為單酶水解法和多酶水解法。多酶水解法又分為混合酶水解法（比如牛胰蛋白酶，鏈霉菌蛋白酶，芽孢桿菌蛋白酶混合）和分步酶水解
胃蛋白酶提取膠原蛋白的電泳圖譜法， 酶法提取皮膠原具體實(shí)驗(yàn)工藝及條件的選取通常應(yīng)考慮要開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品對(duì)分子量的要求，要得到分子量較小的膠原多肽一般采用多酶水解法。影響酶解效果的因素主要 有：酶的種類、加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間、pH值及料水比。采用酶法提取骨料中的膠原蛋白，既能有效縮短提取時(shí)間，又能獲得具有良好生物活性的膠原蛋 白，而且對(duì)環(huán)境的污染也較小。膠原蛋白不易被普通蛋白酶水解，但能被動(dòng)物膠原酶斷裂，斷裂的碎片自動(dòng)變性后可被普通蛋白酶水解。胃蛋白酶水解膠原蛋白的適 宜條件為pH 1.65～1.70、溫度37℃。
有人以豬骨為原料，用蛋白酶的酶解反應(yīng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)制膠工藝，對(duì)骨膠原的酶解反應(yīng)與酶法制膠工藝進(jìn)行了試驗(yàn)研究。結(jié)果表 明：以胃蛋白酶對(duì)骨膠原的提取率最高（46.14%），其次是胰蛋白酶（43.42%），接下來(lái)是中性蛋白酶（30.14%），最后是堿性蛋白酶 （21.15%）。并且通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)對(duì)胃蛋白酶酶解反應(yīng)中各主要影響因素進(jìn)行了優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明，胃蛋白酶提取的最優(yōu)條件是，胃蛋白酶的濃度是 1%，在pH2.0的條件下酶解48h，然后在濃度為10%（w/v）的NaCL溶液中鹽析24h，最后骨膠原的回收率為64.77%，骨膠原的提取率為 49.75%。還有人用胃蛋白酶提取豬皮膠原蛋白，分別在水解0、2、6、10、14、18、22、26h時(shí)對(duì)四種不同胃蛋白酶用量（分別為1%、2%、 2.5%、3%）的試樣取樣檢測(cè)，采用一階HILL方程模擬胃蛋白酶提取豬皮膠原蛋白的進(jìn)程以及胃蛋白酶水解速率的衰減過(guò)程，最后得出2%的胃蛋白酶用量 和6-7h的水解時(shí)間提取率最大。還有人用以新鮮豬皮為原料，在50-52℃的條件下用胰酶進(jìn)行水解，在酶用量為 5000：1～10000：1，pH值為9，反應(yīng)2－3h，原料：水為1：2的條件下酶解。結(jié)果表明：總蛋白質(zhì)的提取率≥80%。
采用酶法提取膠原蛋白時(shí)，必須嚴(yán)格控制提取條件。首先，酶作用時(shí)間必須適當(dāng)。如果時(shí)間過(guò)短，膠原蛋白，就不能充分釋放到提取液中，影響提取率；如果酶作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，膠原蛋白會(huì)水解過(guò)度，產(chǎn)生過(guò)多的苦味小分子低聚肽，不僅會(huì)增加分離純化的難度，也會(huì)影響膠原 蛋白的功能特性和生物活性。其次，酶解溫度要適宜。溫度過(guò)低，酶的作用效果不明顯；溫度過(guò)高會(huì)引起酶的失活和膠原蛋白的變性。據(jù)報(bào)道，當(dāng)介質(zhì)pH略低于中 性時(shí)，膠原蛋白的變性溫度為40～41℃，當(dāng)介質(zhì)pH為酸性時(shí)，膠原蛋白的變性溫度為38～39℃，而且魚皮膠原蛋白的變性溫度要比豬皮膠原蛋白的變性溫 度低7～12℃。所以，如果要使提取的膠原蛋白具有良好的生物活性，在提取過(guò)程中應(yīng)使提取溫度低于變性溫度。第三，需選用適當(dāng)?shù)拿浮Ｒ话銖年懮溉閯?dòng)物組 織中提取膠原蛋白時(shí)，采用胃蛋白酶在其最適作用溫度下進(jìn)行提取是合理的，但對(duì)于魚類等水生動(dòng)物，由于其膠原蛋白的變性溫度比陸生哺乳動(dòng)物低，因此許多蛋白 酶便不適用，如果在這些酶的最適作用溫度下提取可能會(huì)破壞膠原蛋白的某些功能特性和生物活性。采用酶法提取膠原蛋白及其多肽的研究主要是從動(dòng)物皮及其加工 副產(chǎn)物中，應(yīng)用酶法從動(dòng)物骨中提取膠原蛋白及其多肽報(bào)道較少。
純化
可用于膠原蛋白的純化方法包括鹽析法、透析法、離心法、電泳法和色譜法，其中鹽析法、離心法和電泳法最為常用。由于單一方法難以完全分離純化膠原蛋白，實(shí)際 操作都是通過(guò)復(fù)合法來(lái)達(dá)到分離純化膠原蛋白的目的。鹽析法一般采用高濃度NaCl；離心法常選用制備型低溫超速離心機(jī)；電泳法多采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯 酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE），該法既可用于膠原蛋白的分離純化，還可用來(lái)測(cè)定膠原蛋白分子的相對(duì)分子質(zhì)量。像有人用破碎、酶解、鹽析三步法提純蘇 尼特羊骨骼I型膠原蛋白。先去除骨頭里的非膠原物質(zhì)，然后往沉淀中10%的胃蛋白酶，在4℃的條件下消化24h，以14000r/min離心40min。 棄沉淀往上清液中加NaCL，使它終濃度達(dá)到0.9moL/L，靜止過(guò)夜，再離心，最后的沉淀就是I型膠原蛋白。
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自2005年起，我們就與中國(guó)海洋大學(xué)進(jìn)行膠原蛋白及膠原蛋白肽的合作。先后為山東東方海洋集團(tuán)有限公司、青島海大生物集團(tuán)有限公司、北京盛美諾生物技術(shù)有限公司、海南盛美諾生物技術(shù)有限公司、海南華研生物技術(shù)有限公司、越南永環(huán)水產(chǎn)有限公司等多家企業(yè)提供了技術(shù)及設(shè)備。同時(shí)上述企業(yè)也與我們簽訂了鑰匙工程。我們是較早生產(chǎn)膠原蛋白及膠原蛋白肽設(shè)備的廠家。隨著與時(shí)俱進(jìn)，經(jīng)過(guò)研發(fā)我們有效的提高了整條生產(chǎn)線的工作效率及產(chǎn)品的質(zhì)量。
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